ย้ายต้นเนื้อเยื่อบ่อย ต้นจะกลายไหม?

นภสร ตาปะสี
11 นาทีที่ผ่านมา
ยาว 2 นาที

การย้ายต้นหรือ subculture เป็นขั้นตอนปกติของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ เพราะต้นต้องได้รับอาหารใหม่ มีพื้นที่เพิ่มจำนวน และลดการสะสมของเสียในขวด แต่การย้ายบ่อยเกินความจำเป็นหรือย้ายต่อเนื่องหลายรุ่นอาจส่งผลเสียได้ โดยต้องแยกให้ชัดระหว่าง การย้ายถี่เกินไปในแต่ละรอบ กับ การย้ายต่อเนื่องจำนวนหลาย passage เพราะสองกรณีนี้มีกลไกและความเสี่ยงต่างกัน ผลเสียที่มีหลักฐานชัดที่สุดคือ ความเสี่ยงต่อ Somaclonal Variation หรือความแปรปรวนจากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ งานในกล้วย ‘Nanicão’ ที่ติดตามต้นเกือบ 4,000 ต้นพบว่า หลังการ subculture 5 และ 7 รอบพบต้นแปรปรวนประมาณ 1.3% และเพิ่มเป็นประมาณ 2.9% ที่รอบ 9 และ 3.8% ที่รอบ 11 ตัวอย่างนี้แสดงให้เห็นว่าเมื่อสายการผลิตถูกขยายต่อเนื่อง

นานขึ้น โอกาสพบต้นนอกแบบอาจเพิ่มขึ้น และความผิดปกติบางอย่างสามารถแสดงออกถึงระดับคุณภาพเครือและผลผลิต

หลังปลูกจริง ความเปลี่ยนแปลงไม่ได้เกิดเฉพาะสิ่งที่มองเห็นจากภายนอกเท่านั้น งานด้านจีโนมในกัญชาพบว่าต้นที่ผ่านการ subculture หลายรุ่นสามารถสะสมความแตกต่างของ DNA ได้ และความถี่ของความแปรผันมีความสัมพันธ์กับจำนวนรอบการเพาะเลี้ยงในบางระบบ อย่างไรก็ตาม ความสัมพันธ์ไม่ได้เพิ่มเป็นเส้นตรงเสมอไป เพราะงานต่อมาพบว่าการสะสม mutation อาจเด่นมากในช่วงต้นของการตั้งสายเพาะเลี้ยงแล้วค่อย ๆ ชะลอลง ดังนั้นไม่ควรสรุปว่า “ย้ายหนึ่งครั้งเท่ากับเพิ่มการกลายหนึ่งระดับ” แต่ควรมองจำนวน passage เป็น ปัจจัยเสี่ยงสะสม นอกจาก DNA แล้ว การเลี้ยงต่อเนื่องยังสามารถทำให้เกิด การเปลี่ยนแปลงทางอีพีเจเนติก เช่น DNA methylation ซึ่งเปลี่ยนการเปิด–ปิดยีนโดยไม่จำเป็นต้องเปลี่ยนลำดับ DNA ต้นจึงอาจยังดูคล้ายต้นแม่ แต่การเจริญ การตอบสนองต่อสภาพแวดล้อม หรือคุณสมบัติทางสรีรวิทยาเริ่มแตกต่างได้ ตัวอย่างเช่น งานในกัญชาหลาย cultivar พบว่ารูปแบบ methylation เปลี่ยนตามระยะเวลาการ micropropagation และตอบสนองแตกต่างกัน

ระหว่างพันธุ์ อีกปัญหาที่พบในหลายชนิดคือ อัตราการเพิ่มจำนวนยอดลดลงเมื่อเลี้ยงสายเดิมนานเกินไป งานในต้นตอไม้ผลหลาย genotype พบว่า shoot formation capacity ลดลงเมื่อ subculture ต่อเนื่องหลายรอบ แม้จะใช้อาหารและฮอร์โมนสูตรเดิม ตัวอย่างเช่น ช่วงต้นสายหนึ่งต้นอาจเพิ่มได้ 5–6 ยอดต่อรอบ แต่เมื่อเดินสายไปหลาย passage อาจเหลือเพียง 2–3 ยอด

ต่อรอบ สิ่งนี้สะท้อนว่าเนื้อเยื่อสามารถเกิด culture ageing หรือสูญเสีย morphogenic competence ได้ และการเพิ่ม BAP มากขึ้นไม่ได้เป็นวิธีแก้ที่ถูกต้องเสมอไป ในทางตรงกันข้าม การย้ายเร็วเกินไป เช่น ทุก 1–2 สัปดาห์ ก็ไม่ได้มีหลักฐานว่าทำให้กลายพันธุ์โดยตรง แต่สามารถทำให้ประสิทธิภาพการผลิตลดลงได้ เพราะยอดอาจยังสะสมชีวมวลไม่พอ จุดกำเนิดยอดใหม่ยังพัฒนาไม่เต็มที่ และต้นถูกตัดแบ่งซ้ำเร็วกว่าที่จำเป็น ตัวอย่างในสับปะรดพบว่าการยืดระยะการเลี้ยงจาก 30 วันไปถึงช่วงที่

นานขึ้นสามารถช่วยฟื้นการสร้างยอดในบาง passage ได้ แสดงว่า “ย้ายให้เร็วที่สุด” ไม่ใช่หลักการที่ดีที่สุดเสมอไป ความเสี่ยงจะยิ่งสูงขึ้นหากระบบเพิ่มจำนวนต้องผ่าน callus หรือเซลล์ที่แบ่งตัวแบบไม่เป็นระเบียบ เพราะเซลล์ต้อง undergo reprogramming และแบ่งตัวจำนวนมาก งานใน Tetrastigma hemsleyanum พบ polymorphism ทางโมเลกุลเพิ่มขึ้นใน callus เมื่อ subculture หลายรอบ และยังพบว่าปริมาณสาร flavonoid เปลี่ยนหลังเลี้ยงต่อเนื่อง ตัวอย่างนี้สำคัญมากสำหรับพืชสมุนไพรหรือพืชที่มูลค่าทางการค้าอยู่ที่สารสำคัญ เพราะต้นอาจดูเหมือนเดิมแต่คุณสมบัติทางชีวเคมีเปลี่ยนได้ อย่างไรก็ตาม จำนวน subculture ไม่ใช่ตัวเลขที่ใช้ตัดสินเหมือนกันกับทุกพืช มีงานกล้วยบางระบบที่เลี้ยงต่อเนื่องเป็นเวลาหลายปีและ

ไม่พบ polymorphism ด้วย RAPD/ISSR ที่ใช้ตรวจ รวมถึงงาน blackberry ที่ผ่านหลาย subculture แล้วยังไม่พบความแตกต่างจากต้นแม่ภายใต้เครื่องมือที่ใช้ ดังนั้นคำว่า “เกิน 5 รอบต้องกลาย” ไม่ถูกต้อง ตัวเลขที่เหมาะสมต้องกำหนดแยกตามชนิด พันธุ์ วิธี regeneration ระดับฮอร์โมน และข้อมูลจริงของแต่ละสายการผลิต สำหรับห้องปฏิบัติการเชิงพาณิชย์ สิ่งที่ควรทำมากที่สุดคือควบคุม Passage Number ให้เป็นข้อมูลสำคัญของล็อต เช่น Mother Stock → P0 → P1 → P2 → P3 และกำหนด maximum production passage ของแต่ละพันธุ์จากข้อมูลจริง ควรติดตามทั้ง multiplication rate ความยาวและคุณภาพยอด hyperhydricity อัตราออกราก การรอดหลังอนุบาล และอัตรา off-type ตัวอย่างเช่น หาก P1–P5 ยังให้ 5 ยอดต่อชิ้นส่วนและต้นปกติ แต่ P7 เริ่มเหลือ 3 ยอดพร้อมต้นผิดรูปเพิ่มขึ้น ก็ควรหยุดใช้สายปลายรุ่นนั้นเป็นต้นตั้งต้นและย้อนกลับไป

เริ่มจาก Master Culture ที่ผ่านการตรวจสอบแล้ว สรุปคือ การย้ายต้นเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อบ่อยเกินไปไม่ได้ทำให้ต้นเสียทันที แต่การเพิ่มจำนวน passage โดยไม่มีเหตุผลและไม่มีระบบควบคุมเพิ่มความเสี่ยงจริง ทั้งด้านความตรงพันธุ์ อัตราการเพิ่มยอด ความเสถียรทางพันธุกรรมและอีพีเจเนติก รวมถึงคุณภาพหลังออกขวด หลักที่เหมาะสมจึงไม่ใช่ “ย้ายทุกกี่วันให้เร็วที่สุด” แต่คือ ย้ายเมื่อถึงระยะพัฒนาที่เหมาะสม จำกัดจำนวน passage ตามข้อมูลของแต่ละพันธุ์ และรักษา Master Stock สำหรับเริ่มสายใหม่เมื่อสายผลิตเริ่มเสื่อม ตัวอย่างง่าย ๆ คือ กล้วยสายหนึ่งอาจเหมาะกับการผลิตเพียง 5–7 รอบ ขณะที่ไม้ประดับอีกชนิดอาจเสถียรได้มากกว่านั้น จึงไม่ควรใช้ตัวเลขเดียวกันกับพืชทุกชนิด.