เชื้อรา–แบคทีเรียในขวดเนื้อเยื่อ ดูอย่างไรให้แยกได้เบื้องต้น?

7 ชั่วโมงที่ผ่านมา

ยาว 1 นาที

การปนเปื้อนของเชื้อราและแบคทีเรียเป็นหนึ่งในปัญหาสำคัญของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ เพราะจุลินทรีย์สามารถแย่งน้ำตาลและธาตุอาหารจากต้น เปลี่ยนสภาพอาหาร และทำให้ต้นชะงัก เน่า หรือเสียทั้งขวดได้ อย่างไรก็ตาม การดูด้วยตาเปล่าสามารถใช้ได้เพียงเพื่อ คัดกรองเบื้องต้น ไม่ควรใช้ระบุชนิดเชื้อแบบฟันธง เพราะแบคทีเรีย เชื้อรา และยีสต์บางชนิดมีลักษณะโคโลนีคล้ายกันมาก

อาการที่ควรนึกถึง แบคทีเรีย มากที่สุดคือ วุ้นเริ่มขุ่นเป็นฝ้า มีวงขาวบาง ๆ รอบโคนต้นหรือราก มีคราบคล้ายน้ำนม หรือเกิดเมือกและความลื่นบริเวณผิวอาหาร ระยะแรกบางขวดอาจแทบมองไม่เห็นเชื้อเลย เห็นเพียง “วงฝ้าจาง” รอบรอยตัดเท่านั้น ตัวอย่างงานในมันเทศของ International Potato Center พบว่าแบคทีเรียแฝงบางชนิดอยู่ในต้นได้โดยอาหารยังดูเกือบปกติ จึงต้องส่องย้อนแสงและหมุนขวดตรวจรอบด้าน ไม่ควรดูเฉพาะใบด้านบน

เมื่อแบคทีเรียเพิ่มจำนวนมากขึ้น ลักษณะจะชัดขึ้น เช่น อาหารมีสีขาวครีม เหลือง หรือขุ่นเป็นหย่อม มีตะกอนหรือเมือกเกิดรอบโคนต้น งานวิจัยในไม้น้ำ Hygrophila polysperma พบลักษณะแบคทีเรียตั้งแต่คราบขาวน้ำนม กลุ่มสีเหลือง หยดเมือก ไปจนถึงตะกอนสีขาวแห้ง แสดงว่า แบคทีเรียไม่ได้มีหน้าตาเป็นวุ้นขุ่นสีขาวแบบเดียวเสมอไป ตัวอย่างเช่น ขวดหนึ่งอาจมีต้นยังเขียวดี แต่มีเมือกบาง ๆ รอบราก หากปล่อยไว้ 2–3 วันบริเวณนั้นอาจขยายเป็นวงกว้างและต้นเริ่มชะงัก

ส่วน เชื้อราแบบเส้นใย มักมองเห็นได้ง่ายกว่า ลักษณะเด่นคือเริ่มจากจุดเล็ก ๆ แล้วเกิดเส้นใยคล้ายสำลี ใยแมงมุม หรือขนฟู ก่อนแผ่กระจายเป็นวงบนผิววุ้น สีในช่วงแรกมักเป็นขาว จากนั้นบางชนิดอาจเปลี่ยนเป็นเขียว เทา น้ำตาล หรือดำเมื่อสร้างสปอร์ ตัวอย่างเช่น หากเห็นจุดสีขาวบนวุ้นในวันแรก แล้วอีกสองวันกลายเป็นปุยแผ่รัศมีรอบจุดเดิม ควรสงสัยเชื้อราสูงมากและแยกขวดออกจากพื้นที่ผลิตทันที

อย่างไรก็ตาม ไม่ควรใช้สีของเชื้อระบุชื่อเชื้อ เช่น เห็นสีเขียวแล้วสรุปว่าเป็น Penicillium หรือเห็นดำแล้วสรุปว่าเป็น Aspergillus เพราะเชื้อราหลายชนิดมีสีใกล้เคียงกัน และสีจะเปลี่ยนตามอายุของโคโลนี อาหาร และสภาพแวดล้อม นอกจากนี้ ยีสต์ ซึ่งอยู่ในกลุ่มราอาจไม่มีเส้นใยฟู แต่เกิดเป็นโคโลนีสีครีมเรียบหรือทำให้อาหารขุ่นคล้ายแบคทีเรียได้ หากต้องการระบุชนิดจริงจำเป็นต้องเพาะแยก ดูลักษณะด้วยกล้อง และยืนยันด้วยวิธีโมเลกุล เช่น ITS สำหรับเชื้อรา

อีกเรื่องที่ต้องแยกให้ชัดคือ เนื้อเยื่อเป็นสีน้ำตาลไม่ได้แปลว่ามีเชื้อเสมอไป ต้นบางชนิดปล่อยสารฟีนอลหลังถูกตัด ทำให้อาหารรอบรอยตัดเปลี่ยนเป็นสีน้ำตาลคล้ายชาหรือเนื้อเยื่อดำขึ้น เรียกว่า phenolic browning หากไม่มีเมือก ไม่มีฝ้า ไม่มีเส้นใย และบริเวณสีน้ำตาลไม่ขยายตัวเป็นโคโลนี อาจเป็นปฏิกิริยาของพืชเอง ตัวอย่างเช่น ชิ้นส่วนที่เพิ่งฟอกใหม่อาจทำให้อาหารรอบโคนเป็นสีน้ำตาลภายใน 24 ชั่วโมง แต่ยังมียอดใหม่สีเขียวเกิดขึ้นได้ ซึ่งต่างจากการปนเปื้อนที่มักขยายพื้นที่ต่อเนื่อง

สิ่งที่อันตรายมากในระบบผลิตคือ เชื้อแฝงหรือ endophytic contamination เพราะเชื้ออาจอยู่ภายในเนื้อเยื่อตั้งแต่ต้นแม่ จึงไม่ถูกกำจัดทั้งหมดด้วยการฆ่าเชื้อผิว ขวดอาจดูสะอาดในระยะ initiation และ multiplication รุ่นแรก แต่เริ่มพบฝ้าหรือแบคทีเรียในรุ่นถัดมา งานที่ตรวจมันเทศมากกว่า 2,000 accession พบแบคทีเรียแฝงในประมาณ 10% ของตัวอย่าง แสดงให้เห็นว่าการพบเชื้อช้าหลังหลาย passage ไม่ได้หมายความว่าพนักงานรอบล่าสุดเป็นต้นเหตุเสมอไป แต่ควรย้อนตรวจต้นแม่และสายวัฒนธรรมต้นทางด้วย

สำหรับห้องผลิต การตรวจที่มีประสิทธิภาพควรดู โคนต้น รอยตัด รอบราก ผิววุ้น ด้านข้างวุ้น และก้นขวด ไม่ควรดูเฉพาะยอดหรือใบ สามารถแบ่งสถานะเป็น Clean, Suspected และ Confirmed contaminated ได้ เช่น หากเห็นฝ้าจางรอบโคนแต่ยังไม่แน่ใจให้กักขวดไว้ดูการเปลี่ยนแปลง ส่วนขวดที่มีเส้นใยฟูหรือเมือกชัดเจนควรแยกออกจาก stock สะอาดทันที และไม่ควรเปิดขวดเชื้อราในพื้นที่ subculture ปกติ เพราะสปอร์สามารถกระจายไปยังพื้นที่ผลิตได้

สรุปแบบจำง่ายที่สุดคือ แบคทีเรียให้นึกถึง “ฝ้า–ขุ่น–น้ำนม–เมือก–วงรอบโคน” ส่วนเชื้อราให้นึกถึง “จุด–เส้นใย–ปุย–แผ่เป็นวง” แต่ทั้งสองกลุ่มอาจมีข้อยกเว้น และบางครั้งขวดดูปกติก็ยังมีเชื้อแฝงอยู่ได้ ดังนั้นการตรวจด้วยตาเหมาะสำหรับคัดกรองเท่านั้น หากต้องการยืนยันควรใช้การเพาะแยกและกล้องจุลทรรศน์ และสำหรับงานที่ต้องการระบุชนิดอย่างแม่นยำควรใช้ 16S rDNA สำหรับแบคทีเรีย และ ITS sequencing สำหรับเชื้อรา ร่วมกับระบบบันทึกรหัสล็อตและช่วงเวลาที่เริ่มพบการปนเปื้อน เพื่อให้ย้อนหาต้นเหตุและปรับปรุงกระบวนการผลิตได้จริง.